普通生化检测

一、上机生化实验目的及原理

　　1.肝功能八项：肝功能检查的目的在于探测肝脏有无疾病、肝脏损害程度以及查明肝病原因、判断预后和鉴别发生黄疸的病因等

　　谷丙转氨酶(ALT/GPT)：

L-丙氨酸+α-酮戊二酸 ^ALT > 丙酮酸+L-谷氨酸

丙酮酸+NADH+H^+ LDH > 乳酸+NAD⁺

在340nm波长测定NADH每分钟吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性(速率法)

　　谷草转氨酶(AST/GOT)：

L-天冬门氨酸+α-酮戊二酸 ^AST > 草酰乙酸+谷氨酸

草酰乙酸+NADH ^MDH > 乳酸+NAD⁺

在340nm波长测定NADH每分钟吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性(速率法)

　　γ-谷氨酰基转移酶(GGT)：

γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺+双甘氨肽 ^r-G > γ-谷氨酰双甘氨肽+5-氨基-2-硝基甲苯酸，在405nm波长测定每分钟吸光度的变化率△A/分钟)，计算其活性(速率法)

　　总胆红素(T-BIL)：

在PH3左右有表面活性剂和加速剂的条件下，样品中的总胆红素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素。胆红素的黄色特异性吸光度下降，通过测定钒酸盐氧化前后吸光度的变化，计算出样品中总胆红素的含量。(两点终点法)

　　直接胆红素(D-BIL)：

在PH3左右有表面活性剂和加速剂的条件下，样品中的直接胆红素被氧化剂钒酸钠氧化为胆绿素。胆红素的黄色特异性吸光度下降，通过测定钒酸盐氧化前后吸光度的变化，计算出样品中直接胆红素的含量。(两点终点法)

　　碱性磷酸酶(ALP)：

血清中的碱性磷酸酶在碱性条件下作用于对硝基苯磷酸钠，生成对-硝基酚和磷酸盐，在405nm波长测定每分钟吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性(速率法)

　　白蛋白(ALB)：

在PH4.20左右的条件下，白蛋白分子上的正电荷鱼溴甲酚绿上的阴离子集团结合形成绿色的复合物，在630nm波长测定吸光度，计算其含量。(终点法)

　　总胆汁酸(TBA)：

胆汁酸+S-NAD ^3α-HSD > 3-酮类固醇+S-NADH

3-酮类固醇+S-NAGH ^3α-HSD > 胆汁酸+NAD，

不断完成循环反应，在405nm波长测定每分钟S-NADH吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性(两点速率法)

　　2.肾功能三项：反映肾分泌寄代谢功能

　　尿素/尿素氮(UREA/BUN)：

尿素+H₂O+2H^+ 尿素酶 > 2NH₄⁺ +CO₂

2NH₄+ + α-酮戊二酸+NADH^+ GLDH > 谷氨酸+NAD⁺ +H₂O

在340nm波长测定NADH每分钟吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其含量(两点速率法)

　　尿酸(UA)：

尿酸+H₂O+O₂ ^UAO > 尿囊素 +CO₂+H₂O₂

H₂O₂ + 4-AAP+DHBS ^POD > 醌亚胺 +H₂O

在510nm波长测定吸光度值，计算其含量(终点法)

　　肌酐(CREA)：

肌酐+H₂O ^肌酐酶 > 肌酸　　肌酸+H₂O ^肌酐酶 > 肌氨酸+脲

肌氨酸 + H₂O +O₂ ^{肌氨酸氧化酶} > 甘氨酸+HCHO + H₂O₂

2H₂O₂ + 4-AAP+TOOS ^{过氧化物酶} > 红色醌型化合物 +4H₂O

在546nm波长测定红色醌型化合物的吸光度值，计算其含量。(两点终点法)

　　3.血脂四项：

反映血液脂质含量

　　总胆固醇(TC)：

血清中的脂化胆固醇经胆固醇脂酶水解产生游离胆固醇，与原有的游离胆固醇一同被胆固醇氧化酶氧化生成胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢酶使过氧化氢分解出氧的游离基，它同4-氨基安替比林和酚生成红色醌型化合物，在510nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　甘油三酯(TG)：

甘油三酯+H₂O ^脂肪酶 > 甘油+脂肪酸

甘油 + ATP ^甘油激酶 > 甘油-3-磷酸+ADP

甘油-3-磷酸+O₂ ^{3-磷酸甘油氧化酶} > H₂O₂+磷酸羟基丙酮

H₂O₂ +4-氨基安替比林+对氯酚 ^{过氧化物酶} > 红色醌型化合物

在510nm波长下测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)：

通过加入低密度脂蛋白胆固醇的抑制剂，将低密度和极低密度部分隐藏起来，直接测定高密度部分的胆固醇含量。显色反应原理同总胆固醇，在510nm波长测定吸光值，计算其含量。(终点法)

　　低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)：

低密度脂蛋白包括极低密度脂蛋白，能与磷钨酸镁和聚乙二醇复合剂作用产生沉淀，用分散剂可使沉淀颗粒细小均一，在620或630nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　4.血糖：

反映血液糖类含量

　　葡萄糖(Glu)：

血清中的葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下，生成过氧化氢，用过氧化物酶将过氧化氢分解出氧的游离基，它将4-氨基安替比林和酚氧化为红色的醌型化合物，在510nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　糖化血清蛋白/果糖胺(GSP)：

GSP上的酮胺结构使氯化硝基氮唑蓝(NBT)还原成紫色的甲臜，在546nm波长测定标准和样品的吸光度变化率(△A/分钟)，计算其含量。(两点速率法)

　　5.心肌酶谱：

反映心肌损伤

　　肌酸激酶(CK)：

磷酸激酶+ADP ^CK > 肌酸+ATP+H⁺

葡萄糖 + ATP ^HK > 葡萄糖-6-磷酸+ADP+H⁺

葡萄糖-6-磷酸+NADP^+ G6PDH > 6-磷酸-葡萄糖酸+NADPH+H⁺

在340nm波长测定NADPH每分钟吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性。(速率法)

　　肌酸激酶同工酶(CKMB)：

用特异抗CK-M抗体将CK-M抑制，测定CK-B的活性，其中包含50%CK-MB的活性，将测定结果乘以2即为CK-MB的活性。

磷酸肌酸+ADP ^CK-B > 肌酸+ATP+H⁺

葡萄糖 + ATP ^HK > 葡萄糖-6-磷酸+ADP+H⁺

葡萄糖-6-磷酸+NADP^+ G6PDH > 6-磷酸-葡萄糖酸+NADPH+H⁺

在340nm波长测定NADPH每分钟吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性。(速率法)

　　乳酸脱氢酶(LDH-L)：

L-乳酸+NAD^+ LDH-L > 丙酮酸+NADH

在340nm波长测定每分钟NADH吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性。(速率法)

　　乳酸脱氢酶同工酶(LDH-1)：

L-乳酸+NAD^+ LDH1 > 丙酮酸+NADH+H⁺

在硫氰酸胍抑制剂存在的条件下抑制了LDH2-5，在340nm波长测定每分钟NADH吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性。(速率法)

　　6.无机离子：

维持体内的电解质、酸碱平衡和渗透压平衡。

　　钙(Ca)：

在碱性条件下，钙离子与邻甲酚酞络合酮(OCPC)形成紫红色复合物，用8-羟基喹啉消除镁离子的干扰，在578nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　氯(Cl)：

2Cl^– +Hg(SCN)₂       > HgCl₂+2SCN^–

2SCN^– + Fe³⁺        > Fe(SCN)₃

在510nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　无机磷(IP)：在酸性条件下，样本中的无机磷与钼酸铵反应生成非还原性磷钼酸化合物，

　　在340nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　镁(Mg)：在碱性条件下，镁离子与染料Calmagite结合，生成紫红色复合物，在546nm

　　波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　铁(Fe)：血清中的三价铁被还原剂还原为二价铁，二价铁同菲啰嗪形成紫色的化合物，在578nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　锌(Zn)：血清中的锌离子与锌试剂形成蓝色化合物，由于显色剂本身为红色，在低含量水平范围呈紫色，除干扰剂将样本中的铜离子、铁离子隐蔽起来，在630nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　钠(Na)：邻硝基酚-β-D-半乳糖苷在钠依赖性β-D-半乳糖苷酶催化下生成邻-硝基酚和半乳糖，邻-硝基酚的生成量和样品中钠离子的浓度呈正比。邻-硝基酚在碱性环境中呈黄色，可在405nm波长处检测吸光度的升高速度，计算钠离子的浓度。(两点速率法)

　　钾(K)：血清中的钾离子在蛋白水解酶的作用下，从蛋白分子的吸附下解脱出来与四苯硼锂呈浊度反应，在620nm或630nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　7.总蛋白(TP)：

样本中蛋白质分子的肽键与双缩脲试剂中的铜结合形成紫色化合物，在546nm波长测定吸光度值，计算其含量。(终点法)

　　8.α淀粉酶(AMS)：

Gal-G₂-CNP ^a-AMY > Gal-G₂+CNP

在405nm波长测定每分钟CNP吸光度的变化率(△A/分钟)，计算其活性。(速率法)

　　二、尿常规相关

　　A、尿常规检测项目及意义

　　1、检测项目：

对尿液中的白细胞(WBC)、酮体(KET)、亚硝酸盐(NIT)、尿胆原(URO)、胆红素(BIL)、蛋白质(PRO)、葡萄糖(GLU)、尿比重(SG)、酸碱度(PH)、隐血(BLD)、肌酐(CR)、尿钙(Ca)、微白蛋白(MA)十三项化学指标进行半定量或定性检测，为诊断和科研提供参考，适用于筛选试验或辅助诊断。

　　2、采用干化学法，配套尿液分析仪对尿液中各项待测成分进行检测，尿液中的各项待测成分可使尿试纸条上相应的试剂块发生颜色变化，反应颜色的深浅与尿液中相应待测成分浓度成一定比例关系。通过此方法对泌尿系统疾病、肝胆疾病、糖尿病等疾病进行辅助诊断与疗效观察，尿干化学检测仅作为筛选试验，并且不能以此作为单一的诊断方法。

　　B、检测原理

　　1、空白块(校正块)：

尿在测试块上分布的状态及尿本身的颜色一般都会给测定结果带来误差，设空白块就是为了排除这些产生误差的因素，各项目都使用同一空白块。

　　2、白细胞：

根据酯酶法的原理，粒细胞浆内还有酯酶，这种酶能水解一种3-羟基吲哚酚酯类底物，释放出酚从而与重氮试剂反应生成紫红色化合物。

　　3、酮体：

根据硝普酸钠法原理，硝普酸钠和酮体(乙酰乙酸)在碱性条件下相互作用而呈现紫色，特别是乙酰乙酸对此特别灵敏。

　　4、亚硝酸盐：

反应依赖于尿中革兰氏阴性细菌把硝酸盐还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐与对氨基苯砷酸反应生成重氮化合物，重氮化合物再与萘基乙二胺二盐酸结合呈现出桃红色。

　　5、尿胆原：

根据偶氮结合法的原理，尿胆原在强酸条件下和重氮盐偶联形成胭脂红色素。

　　6、胆红素：

根据偶氮偶合法的原理，2，4-二氯苯胺重氮盐与胆红素进行特异性反应，并与胆红素的浓度相应产生不同的颜色。

　　7、蛋白质：

根据染料结合的蛋白误差法原理，蛋白质与染料结合形成复合物产生色变，特别是对白蛋白的反应比对球蛋白、血红蛋白、本-周氏蛋白和粘蛋白更为灵敏。

　　8、葡萄糖：

根据葡萄糖氧化酶法反应原理，葡萄糖氧化酶特异性氧化β-D-葡萄糖，生成葡萄糖醛酸和过氧化氢，过氧化氢在过氧化物酶的作用下，使指示剂氧化而呈现出紫红色。

　　9、尿比重：

利用多聚电解质方法，尿中电解质与聚电解质发生离子交换的原理。阳离子存在时，多聚物氢离子通过交换释出，使溴百里酚蓝指示剂发生颜色变化，颜色由蓝经过蓝绿最后变成黄色。

　　10、酸碱度：

通过PH指示剂测定5.0-9.0的范围内的PH值。

　　11、隐血：

根据血红蛋白接触活性法原理，通过血红蛋白的类过氧化物酶样作用催化分解过氧化物，使四甲基联苯胺氧化呈色。

　　12、肌酐：

根据肌酐与3,5-二硝基苯甲酸反应产生紫红色，颜色深浅与肌酐的浓度成正比关系。

　　13、尿钙：

根据钙离子与邻甲酚酞络合酮反应产生紫红色，颜色深浅与钙离子的浓度成正比关系。

　　14、微白蛋白(微量白蛋白)：

根据染料结合的蛋白误差法原理，微量白蛋白与染料结合形成复合物产生色变，对白蛋白的反应灵敏。

　　C、样本的采集与保存

　　1、留取尿液标本一般应尽量采用新鲜晨尿，因为夜间饮水较少，肾脏排到尿液中的多种成分都储存在膀胱内并进行浓度，易于查到，提高阳性检出率，其他随机留取的尿液也可，但应以留取中段尿为好。

　　2、按排尿的先后测序，可将尿液分为前段、中段、后段。因前段尿和后段尿容易被污染，因此，一般都留取中段尿。

　　3、女性留取尿标本时应避开经期，以防止阴道分泌物混入尿液中，影响检查结果。

　　D、实验要求

　　1、样本要求：

不要在尿样中加入防腐剂。尿样不可离心，测试前将尿样混匀。注射或服用维生素C会使亚硝酸盐、胆红素、葡萄糖、隐血检测结果偏低甚至出现假阴性，应用药10小时后再进行测定。

　　2、环境要求：

环境温度(25±5)℃，相对湿度≤80%，推荐最佳测试温度23-27℃。

　　三、凝血相关

　　1、抽取静脉血，自己配置3.8%(或3.2%)的枸橼酸钠抗凝剂：需要按照9份静脉血、1份抗凝剂的比例取样，轻轻颠倒10次使之充分混匀，不得有凝块，不得形成泡沫，离心后提取上清，然后干冰运输。成品抗凝剂管按抗凝管规格加入全血量，使其抗凝剂与血液的比例为1：9，举例：真空采血管中含有3.2%枸橼酸钠抗凝剂约0.2mL，采血至2.0mL。

采样后应尽快分离血浆(60分钟内进行)，将标本以3000r/min离心10-15分钟，使血浆分层，取上层血浆。

　　2、血浆室温放置，宜在2小时内检测。血浆若不能及时检测，分离后的血浆-20℃以下密封可保存2周，干冰运输。测定前37℃快速融化，轻微混匀后立即检测。

　　3、对凝固、有凝块、严重溶血、重度黄疸、脂血、采血量不符合要求或无标识等不合格的标本，距采集时间超过2小时并且没有按要求储存的样本，应按照不合格标本处理